Исследование цитокинового (интерлейкины) профиля в RT-PCR

Алексеев Андрей Викторович
Алексеев Андрей Викторович Врач клинической лабораторной диагностики,

Анализ цитокинового профиля (интерлейкины) в RT-PCR

Цитокины – белково-пептидные медиаторы, отвечающие за межклеточное взаимодействие, регулирование эмбрионального развития, ряд физиологических функций, восстановление поврежденных тканей, защитные реакции в ответ на патогены и опухолевые процессы. Они участвуют в формировании иммунопатологических процессов, связанных с аллергическими, аутоиммунными и иными механизмами. Цитокины играют существенную роль как в нормальном функционировании организма, так и в течении патологических процессов. К цитокинам относится свыше 200 видов соединений: интерлейкины, интерфероны, хемокины, ростовые, колониестимулирующие факторы, фактор некроза опухолей и целый ряд других веществ.

Для чего назначают анализ цитокинового профиля (интерлейкины) в RT-PCR

Анализ цитокинового профиля (интерлейкины) в RT-PCRСодержание цитокинов в биологических жидкостях определяется с несколькими целями: изучение воспалительной активности, определение иммунного ответа, оценка эффективности терапии, прогнозирование исхода заболевания. Во многих случаях уровни отдельных цитокинов меняются в зависимости от тяжести заболевания и прогноза. В частности, уровень интерлейкина-6 определяют в плазме пациентов с тяжелыми травмами: значительное повышение показателя считается предиктором полиорганной недостаточности. Еще один пример: высокие уровни интерлейкина-8 в спинномозговой жидкости пациентов, имеющих метастазы солидных опухолей, ассоциируются с неблагоприятным прогнозом. Однако в большинстве случаев по содержанию какого-либо одного цитокина диагностировать заболевание или оценить его прогноз не представляется возможным. Для более полной оценки иммунологического статуса таким пациентам следует определять широкий спектр интерлейкинов для оценки всех особенностей цитокиновой регуляции.

Синтез цитокинов подвержен сложным механизмам регуляции, в связи с чем изменения экспрессии одного из них часто отражается на концентрациях других. При этом скорость образования цитокинов может различаться и определяться целым рядом физиологических особенностей организма и тем, как взаимодействуют главные адаптационные системы: эндокринная, нервная, иммунная. Поэтому определять разные цитокины в образцах биологических жидкостей лучше одновременно, применяя комплексный режим оценки, как в случае с анализом цитокинового профиля. Это позволит снизить риск ошибок при интерпретации результатов.

Что представляет собой цитокиновый профиль (интерлейкины)

Анализ цитокинового профиля является одним из важнейших иммунодиагностических инструментов. С его помощью оценивают функциональные соотношения базисных субпопуляций лимфоцитов Т-хелперов — Th1, Th2, Th17. Функциональные характеристики Th1-субпопуляции оценивают по продукции иммунными клетками интерферона-γ. Маркером Th2-субпопуляции является интерлейкин-4. Основным цитокином Th17-субпопуляции служит ИЛ-17А.

Цитокины участвуют в регуляции взаимодействия, размножения и функционирования клеток, участвующих в иммунных реакциях, связанных с воспалением. Эти медиаторы влияют на направление дифференцировки лимфоцитов, что ведет к развитию того или иного типа воспалительной реактивности. В частности, вирусная инвазия вызывает дифференцировку Т-хелперов с формированием субпопуляции Th-1 лимфоцитов, ответственных за выработку интерферона-γ, в то же время бактериальная инфекция активирует формирование субпопуляции Th-2. Цитокины не обладают антигенной специфичностью, поэтому с помощью цитокинового профиля или определения отдельных цитокинов нельзя провести специфическую диагностику инфекционных и аллергических патологий. Однако исследование цитокинового профиля помогает определить тяжесть воспаления, выявить синдром системной воспалительной реакции, дать прогноз заболевания. Определение соотношения процессов активации разных типов Т-хелперов на основании цитокинового профиля облегчает дифференциальную диагностику при инфекционных и иммунопатологических заболеваниях.

Что выявляют с помощью анализа и кому его назначают?

Что выявляют с помощью анализаАнализ цитокинового профиля позволяет оценить тяжесть патологии и спрогнозировать течение заболевания. С этой целью определяют концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов как в начале болезни, так и в динамике развития патологии.

По показаниям содержание цитокинов может определяться не только в сыворотке крови, но и в других биологических жидкостях (в моче, бронхоальвеолярной жидкости, слюне, конденсате выдыхаемого воздуха, синовиальной жидкости и других). Дополнительные данные могут быть получены при исследовании способности клеток вырабатывать те или иные цитокины.

К воспалительным цитокинам относятся фактор некроза опухоли альфа, интерлейкины-1, -6, -8, -12. Противовоспалительными свойствами обладают интерлейкины-4, -10, -11, -13. Лекарственные препараты, подавляющие провоспалительные цитокины, назначаются с целью восстановления баланса между этими двумя группами цитокинов.

Исследование цитокинового профиля показано пациентам, имеющим одно из следующих патологических состояний:

  • Инфекционные заболевания, аутоиммунные процессы, ревматологические патологии, ассоциированные с хроническим воспалением. Анализ может помочь в оценке тяжести и прогноза при атеросклерозе, сахарном диабете, хронической обструктивной болезни легких и некоторых других патологиях.
  • «Цитокиновый шторм», связанный с инфекционным процессом или онкопатологией.

Когда назначают анализ?

Исследование интерлейкинов проводят как в рамках первичной диагностики для определения тяжести течения и прогноза заболевания, так и для контроля эффективности терапии. 

Как правильно подготовиться к исследованию?

Перед взятием биологического материала для анализа на цитокиновый профиль (интерлейкины) специальной подготовки не требуется. Кровь берется натощак или не ранее, чем через 4 часа после еды. Разрешается пить обычную воду (без минерализации и газирования).

Метод исследования

Метод исследования цитокинового профиля (интерлейкины) в RT-PCRСуществует несколько подходов к определению цитокинов в биологических образцах: иммунохимические методы, оценка биологической активности, молекулярно-биологические методы. Последние представляют собой опосредованную оценку синтеза цитокинов по экспрессии соответствующих генов, определяемой по накоплению матричной РНК. Присутствие мРНК в тканях может определяться различными методами, в частности, с использованием гибридизации со специфическими зондами из олигонуклеотидов, соответствующих генам определяемых цитокинов. Методики для выявления мРНК отличаются в зависимости от метки, которую содержат зонды: радиоактивная, флюоресцентная или ферментная. С помощью этого метода можно определить число и тип клеток, экспрессирующих интерлейкиины. Методика имеет недостаток: в отдельных случаях присутствие мРНК не коррелирует с наличием соответствующего цитокина. Накопление большого количества мРНК может не сопровождаться синтезом белка. Такое бывает при некоторых патологических состояниях. Кроме того, к появлению различных изоформ мРНК приводит альтернативный сплайсинг. Поэтому более полная информация может быть получена с помощью комбинации методов, оценивающих не только экспрессию мРНК, но и синтез цитокинов.

К инновационным количественным методам, определяющим цитокиновую мРНК, относится полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR). Методика отличается высокими показателями чувствительности и специфичности. Сегодня применяются различные модификации метода, в том числе ПЦР в реальном времени, микрочипы для одновременного анализа нескольких сотен генов и другие.

Что означают результаты?

При оценке результатов анализа цитокинового профиля опираются на сам факт повышения или понижения отдельных цитокинов у обследуемого пациента с конкретной патологией. Значимость полученных результатов можно определить только в ходе комплексной оценки всех имеющихся данных. Показатели цитокинового профиля позволяют оценить тяжесть заболевания и составить прогноз. С помощью исследования можно предположить, какая лечебная схема будет эффективна, а какая нет. Это поможет выбрать оптимальную тактику лечения в самом начале. Изучение показателей в динамике помогает определять реакцию иммунной системы на предпринимаемую терапию и своевременно вносить коррективы в лечение.